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細胞計數專題 | 熒光染料與自動細胞計數儀：單細胞基因組學中可靠的核質量評估

來源：廣州虹科電子科技有限公司   2025年06月21日 12:26   3

在單細胞基因組學研究中，準確評估細胞核質量至關重要。將熒光染料與自動細胞計數儀等成像工具結合使用，是評估細胞核質量的有效方法。在眾多熒光染料中，選擇組合以評估核質量對于確保結果的可靠性至關重要。

此外，隨著現代自動細胞計數儀（如點成LUNA-FX7™和點成LUNA-FL™）功能日益強大，深入了解這些系統在不同熒光染料組合下的表現顯得尤為必要。本研究旨在通過分析不同細胞類型、不同系統以及核固定條件下的熒光染料組合，找出的評估核質量的方法。我們希望通過全面的分析，為單細胞基因組學研究中的核質量評估程序提供優化指導并提高評估的準確性。

1. 材料與方法

本研究使用了四種不同的熒光染料，且每種染料的最終濃度均有所不同：28 µM的嘧啶橙（AO），12.5 µM的鈣黃素（AM），15 µM的碘化丙啶（PI），以及20 µM的EthD-1。這些染料組合成AO/PI、AO/EthD-1、Calcein AM/PI和Calcein AM/EthD-1四種染料。每種組合取各染料1µL，總體積為2µL，隨后與18 µL細胞樣本混合。

2. 核質量評估的熒光染料組合

實驗旨在找出的染料組合，使用不同熒光染料評估U937細胞核和3T3細胞核的質量。理論上，完整的細胞應僅被膜透性染料（如AO和Calcein AM）選擇性染色。而去除膜后的分離細胞核則應被非膜透性染料（如PI和EthD-1）染色，顯示出與死亡細胞類似的活性狀態。
在AO/PI、AO/EthD-1、Calcein AM/PI和Calcein AM/EthD-1這四種染料組合中，AO與PI或AO與EthD-1的組合能夠準確顯示完整細胞和分離細胞核的活性（圖1A）。綠色和紅色信號的存在，使其能夠有效檢測U937細胞和3T3細胞的活性。然而，在3T3細胞中幾乎沒有檢測到Calcein AM信號，而在U937細胞中約有三分之二的細胞顯示出Calcein AM信號（圖1B）。這種差異可以歸因于Calcein AM對酯酶活性的依賴性，而酯酶活性可能因不同細胞類型而異。因此，使用Calcein AM會遺漏部分完整細胞，從而降低活性評估的可靠性。

圖1.(A) 使用AO和PI組合以及AO和EthD-1組合對U937細胞和3T3細胞的染色結果。(B)使用Calcein AM和PI組合以及Calcein AM和EthD-1組合對U937細胞和3T3細胞的染色結果。

3. 定量核質量評估

點成LUNA-FX7™ 和 點成LUNA-FL™系統是功能強大的分析平臺，能夠無縫捕獲明場圖像和熒光圖像，并通過熒光信號分析獲得細胞大小、活性和數量等寶貴數據。

評估分離核質量時，可利用這些系統提供的平均細胞大小數據。例如，去除膜后的細胞核尺寸顯著小于完整細胞，這是因為去除細胞膜和細胞質會使細胞大小減少數微米。特別的是，點成LUNA-FL™和點成LUNA-FX7™能夠從明場圖像中提取細胞大小信息，因此能地避免因熒光強度可能引起的細胞大小測量偏差。這確保了在評估分離核質量時，細胞大小測量的可靠性更高。

采用熒光染料檢測細胞活性是核質量評估的另一個有用數據。如圖1所示，當使用AO/PI或AO/EthD-1組合時，健康的完整細胞顯示接近99%的活性，而分離核顯示接近0%的活性值。像點成LUNA-FL™和點成LUNA-FX7™這樣的自動細胞計數儀能夠在這些染料的作用下，準確量化分離核的濃度（圖2）。這些結果提供了重要數據，驗證了核質量，為后續應用奠定了基礎。

圖2. 顯示使用不同染料組合（AO/PI和AO/EthD-1）對U937細胞和3T3細胞染色結果的拼接圖。圖中還展示了來自點成LUNA-FX7™(A)和點成LUNA-FL™(B)的定量分析結果。

4. PFA固定后的核染色

核固定是長期保存的常見操作，因為它有助于保存細胞結構并便于后續分析。因此，為驗證上述核質量評估方法是否適用于固定的核，我們使用AO/PI和AO/EthD-1對PFA固定的核進行測試。使用AO/PI染料組合時，無論固定狀態或染料培養時間如何，均可觀察到明顯且強烈的PI熒光信號，這表明AO/PI染料可用于新鮮的分離核和固定核分析。然而使用AO/EthD-1時，固定核的EthD-1紅色熒光信號減少，即使延長染料培養時間，熒光信號也沒有增加。為解決這一問題，我們調整了自動細胞計數儀的曝光值，將其從默認的5增加到8。這一調整產生了更強的紅色信號，與AO/PI組合的效果相當。這些結果表明，使用AO/EthD-1染料時，固定核的熒光信號會有所減弱，因此可能需要調整自動細胞計數儀的參數。

圖 3. 顯示使用AO/PI和AO/EthD-1對核在PFA固定前后染色結果的拼接圖。右側還展示了使用曝光設置為8時獲得的圖像。

結論

在快速發展的單細胞基因組學研究領域，精確評估核質量是實現可靠研究結果的基石。研究評估的染料組合中，AO/PI和AO/EthD-1在區分完整細胞與分離核的活性差異方面表現出色。值得注意的是，AO/PI對新鮮核和固定核均表現出良好的效果，而AO/EthD-1在固定核的應用中需要優化。本研究通過結合適當的染料組合與的點成LUNA-FX7™和點成LUNA-FL™系統，提出了一種高效且可靠的分離核質量評估方法。這一成熟的方法為核質量評估提供了寶貴的技術手段，從而推動了單細胞基因組學研究的進步。

點成LUNA-FX7™
點成LUNA-FL™

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