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微流控專題 | 抑制NADPH氧化酶阻斷NETosis并減少肝素誘導的血小板減少癥中的血栓形成

來源：廣州虹科電子科技有限公司   2025年06月21日 09:06   2
肝素誘導性血小板減少癥 (HIT) 是對抗凝劑肝素的嚴重免疫反應。該病癥表現為血小板減少癥（血小板計數低）和動脈或靜脈血栓形成。如果不及時治療，HIT 可導致心臟病發作、中風、肺栓塞、動脈阻塞、肢體壞疽和死亡。

在 HIT 中，抗體識別血小板因子 4 (PF4) 和肝素或多聚陰離子并與之形成復合物。該免疫復合物與 Fc?RIIa 受體相互作用，導致血小板活化和聚集。血小板活化會導致釋放刺激凝血并延續循環的因子。

但其他因素會導致 HIT 中的血栓形成，例如中性粒細胞活化。HIT 免疫復合物與中性粒細胞上的 Fc?RIIa 受體的結合會誘導中性粒細胞胞外陷阱 (NET) 的釋放和 NETosis，這是一種受調節的細胞死亡過程。

到目前為止，HIT 中 NET 形成的分子機制尚未了解。可能涉及特定激動劑，如二核苷酸磷酸 (NADPH)、氧化酶 (NOX) 和氧物種 (ROS)。新南威爾士大學 (澳大利亞悉尼) 的研究人員調查了 ROS 和 NOX 是否是 HIT 誘發的血栓形成所必需的，以便更好地了解這些機制。

研究概述

HIT 樣本

研究人員從健康志愿者和 HIT 患者身上采集血液樣本。

微流體研究

該小組使用 點成Vena8 Fluoro+ 生物芯片微通道進行了微流體研究。

首先，他們在 4C 下用纖維蛋白原或血管性血友病因子 (WWF) 覆蓋微芯片過夜。用牛血清清洗和阻斷微芯片后，他們用 DPI（一種 ROS 抑制劑）孵育來自健康供體的新鮮檸檬酸抗凝全血。他們用純化的 IgG（HIT 或正常）和肝素對其進行處理。

針對中性粒細胞的 ROS 抑制試驗

研究人員在本次實驗中使用了經過或未經過 DPI 處理的中性粒細胞耗盡血液。他們用 Hoechst 33342、Sytox Green、抗 CD41 或 AP2、抗 CD15 和 CellROX 標記樣本。然后，他們以 67 達因/cm2（1500 s-1）的剪切應力灌注血液長達 30 分鐘。

為了可視化生物芯片，他們使用 Q-Imaging EXi Blue 相機連接到由 VenaFluxAssay 軟件（點成Cellix Ltd）驅動的熒光顯微鏡，然后進行定量分析。

結果

HIT 中的血栓形成需要中性粒細胞衍生的 ROS

當研究人員分析血栓時，他們看到血凝塊內有大量的血小板、中性粒細胞、ROS 和釋放的 DNA（圖 3A）。 HIT 患者的循環血小板和中性粒細胞也產生了更多的 ROS。

HIT 中的血栓形成需要中性粒細胞衍生的 ROS

當研究人員分析血栓時，他們發現血凝塊內有大量的血小板、中性粒細胞、ROS 和釋放的 DNA（圖 3A）。HIT 患者的循環血小板和中性粒細胞也產生了更多的 ROS。

圖 3A 來自 Chong 等人。HIT IgG 誘導的 NETosis 和含有 ROS 的血栓。（A）全血中 KKO 誘導的血栓的共聚焦顯微鏡圖像，顯示血小板（紅色）、中性粒細胞（綠色）、ROS（洋紅色）和 DNA 釋放（藍色）。

KKO 和 HIT IgG 誘發的血栓顯示細胞外 DNA、血小板和中性粒細胞明顯沉積（圖 4 A-B）。用 DPI 處理血液可顯著減少這些成分和血凝塊大小。這一觀察結果證實了 ROS 在 HIT 相關血栓形成中的核心作用。

圖 4A-B 來自 Chong 等人。抑制 ROS 可減少血凝塊形成和流動條件下的 NET 釋放。（A）用同型對照和肝素或 KKO 和肝素加載體對照或 DPI 處理的全血的熒光圖像。（B）用正常人 IgG (hIgG) 和肝素或代表性 HIT IgG 和肝素加載體對照或 DPI 處理的全血。細胞外 DNA（藍色）、中性粒細胞（綠色）和血小板（紅色）。

HIT 中的中性粒細胞衍生 ROS 和血栓形成

在用載體處理的中性粒細胞重建的 HIT IgG 處理血液中，研究人員觀察到充滿細胞外 DNA、中性粒細胞和血小板的大凝塊。他們在用正常 IgG 處理的重建血液中沒有觀察到這些特征（圖 5）。

圖 5 來自 Chong 等人。針對中性粒細胞的 ROS 抑制阻斷了全血中的 NET 和血栓形成。（A）熒光圖像顯示細胞外 DNA（藍色）、中性粒細胞（綠色）和血小板（紅色）。

用 DPI 處理重組血液可顯著減少 HIT IgG 治療后的 DNA、中性粒細胞和血小板沉積。

這些數據表明中性粒細胞衍生的 ROS 與 HIT 中的血栓形成之間存在直接聯系。

本研究中的其他實驗

中性粒細胞中的 ROS 生成

實驗涉及用 HIT 患者 IgG 或 KKO、PF4 和肝素刺激純化的中性粒細胞。KKO 處理的中性粒細胞顯示出增強的 ROS 生成。

HIT IgG 介導的中性粒細胞活化和 NETosis

該實驗涉及在肝素存在下用 KKO 或 HIT IgG 治療健康血液。與對照組相比，治療增加了全血和 LDG 群體中經歷 NETosis 的中性粒細胞。DNP 和 DPI 阻斷了 HIT IgG 誘導的 LDG 中的 ROS 生成。

體內研究

該小組還使用表達人類 Fc?RIIa 的 R131 異構體和人類 PF416 的雙轉基因 Fc?RIIa+/hPF4+ 小鼠進行了動物研究。他們注射了 HIT 樣單克隆抗體 KKO 和肝素以在這些動物中誘導 HIT。然后，他們給動物施用 ROS 抑制劑，并分析其肺部和血小板計數。

這些實驗的主要發現

  • 未經 DPI 治療的 KKO 治療小鼠肺部出現大量發光積累。DPI 治療降低了發光，表明 ROS 受到抑制。（補充圖 5A）
  • 經 DPI 治療的 HIT 小鼠循環中活化中性粒細胞 (LDG) 和 ROS+ 細胞減少，與對照水平相似。這些結果與微流體觀察結果一致，其中 ROS 抑制阻斷了中性粒細胞活化。（補充圖 5D）
  • 用 KKO 和肝素治療的小鼠肺部出現密集的血小板積聚和血栓形成。（圖 6）
  • 用 DPI 抑制 ROS 可減少 HIT 誘導的血栓形成，支持微流體研究。
  • DPI 無法預防血小板減少和體溫過低。

結論

研究人員得出結論：

  • ROS 和 NOX2 在 HIT 中的 NETosis 和血栓形成中起著至關重要的作用。
  • NOX2 可能是 HIT 抗血栓治療的新治療靶點。
點成解決方案

實驗室解決方案

如果您對上述實驗感興趣，這是您在實驗室進行類似實驗所需的設備：

  • 點成Vena8 Fluoro+ 生物芯片 – 模擬人體血管和血凝塊，詳情見下方鏈接。
  • 點成Mirus Evo 泵或 點成ExiGo 泵 – 控制生物芯片中的剪切速率（流速）；這使您可以將剪切速率設置為模擬微血管或其他血管中血栓形成的流速的設置。
  • 微環境室 – 這是一個溫控框架，生物芯片位于其中，它將所有溫度保持在 370C。微環境室位于顯微鏡臺上。
  • 倒置顯微鏡 – 我們提供帶有 VenaFlux Pro 選項的 Zeiss AxioVert A1 或帶有 VenaFlux Elite 選項的 Zeiss AxioObserver7。
  • 數碼相機 – 用于捕捉圖像和視頻錄制。我們為 Prime BSI Express 提供 VenaFlux Pro 和 Elite 選項。這是一款出色的相機，具有高幀率，適合血栓研究。
  • Image Pro 細胞分析軟件 – 用于分析實驗中的圖像和視頻。

如果您的實驗室已經擁有其中一些物品（如倒置顯微鏡、相機或細胞分析軟件），我們推薦 VenaFlux 入門套件。

點成Vena8 Fluoro+ 生物芯片

點成Mirus Evo™ 納米泵

點成ExiGo微流體注射泵

參考文獻

Leung, Halina HL, et al. “Inhibition of NADPH oxidase blocks NETosis and reduces thrombosis in heparin-induced thrombocytopenia.” Blood Advances 5.23 (2021): 5439-5451.

關鍵詞：顯微鏡
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