高效液相色譜儀的使用注意事項

一、流動相制備與管理

1. 溶劑純度與過濾要求

• 試劑選擇：使用 HPLC 級溶劑（如乙腈、甲醇），避免分析純試劑中的雜質污染色譜柱或檢測器（雜質可能在 UV 檢測中產生假峰）。

• 脫氣處理：流動相需經超聲脫氣 15-30 分鐘（或使用在線脫氣機），未脫氣的流動相可能導致泵壓力波動、檢測器基線漂移或氣泡堵塞管路。

• 過濾強制要求：水相需用 0.22μm 或 0.45μm 微孔濾膜過濾（去除微生物或顆粒雜質），有機相可選用尼龍膜或 PTFE 膜，混合流動相應先過濾再混合（避免鹽類析出）。

2. 緩沖鹽使用禁忌

• 濃度與 pH 限制：緩沖鹽濃度不宜超過 0.1M（如磷酸鹽緩沖液＞0.05M 時易結晶），流動相 pH 需在色譜柱耐受范圍（通常反相柱 pH 2-8，柱可至 pH 1-12），超出范圍會導致固定相流失或硅膠基質溶解。

• 梯度洗脫注意：含緩沖鹽的流動相進行梯度洗脫時，需確保有機相比例緩慢增加（如乙腈從 5% 升至 95% 的時間≥10 分鐘），避免鹽類在高有機相條件下析出堵塞管路。

• 使用后沖洗：實驗結束后，必須用 10% 甲醇 / 水以 0.5-1.0mL/min 流速沖洗泵和色譜柱 30-60 分鐘（去除緩沖鹽），禁止直接用純有機相沖洗含緩沖鹽的系統（鹽結晶會損壞泵頭和色譜柱）。

二、儀器啟動與系統檢查

1. 開機順序與預熱要求

• 開機流程：先開啟泵、柱溫箱、檢測器等硬件設備，再啟動工作站軟件（避免軟件與硬件通訊故障）；UV 檢測器需預熱 30 分鐘以上（氘燈穩定），示差折光檢測器（RID）需預熱 1-2 小時（溫控系統穩定）。

• 壓力初始化檢查：開機后以低流速（0.3-0.5mL/min）沖洗系統 10 分鐘，觀察壓力是否穩定（初始壓力應與歷史數據偏差＜10%），若壓力驟升可能是管路堵塞（如過濾器或色譜柱入口污染），壓力驟降需檢查泵是否漏氣或單向閥失效。

2. 系統適用性測試

• 標準品驗證：使用已知濃度的標準品（如甲苯）進行系統適用性測試，需滿足：

• 理論塔板數（n）≥藥典或方法要求（如反相柱測甲苯 n≥5000）；

• 拖尾因子（T）在 0.95-1.05 之間，重復性 RSD≤2.0%；
  若指標不達標，需排查色譜柱污染、進樣量不準確或流動相配比錯誤。

三、樣品處理與進樣規范

1. 樣品前處理要點

• 溶解與過濾：樣品需用流動相或相近極性溶劑溶解（避免溶劑效應導致峰展寬或裂峰），并用 0.22μm 濾膜過濾（尤其是生物樣品、中藥提取物等復雜基質，未過濾的顆粒會堵塞進樣針或色譜柱）。

• 濃度與進樣量控制：樣品濃度不宜過高（避免色譜柱過載導致峰形畸變），常規反相色譜進樣量建議≤20μL（根據柱徑調整，如 4.6mm 柱建議 10-20μL），大體積進樣需配合預柱保護。

2. 進樣系統操作禁忌

• 手動進樣閥使用：進樣時需確保閥位切換到位（如六通閥從 “LOAD" 到 “INJECT" 需快速旋轉），避免在切換過程中漏液或樣品殘留；進樣針使用后需立即用洗針液清洗（如甲醇 / 水 = 3:1），防止高粘度樣品凝固堵塞針孔。

• 自動進樣器維護：樣品盤需保持干燥清潔，避免樣品瓶漏液污染進樣針座；洗針液需定期更換（建議每天更換一次），防止微生物滋生或雜質沉積。

四、色譜柱使用與保護

1. 安裝與沖洗規范

• 安裝方向：色譜柱需按標識方向連接（反相柱通常箭頭指向檢測器），反向使用會導致柱效急劇下降（固定相坍塌）；連接管路時需確保接口無漏液（手緊后再用扳手輕擰 1/4 圈，避免過緊損壞螺紋）。

• 使用前預處理：新柱使用前需用 10 倍柱體積的初始流動相平衡（如方法流動相為甲醇 / 水 = 70:30，先用 5% 甲醇 / 水沖洗 10 分鐘，再逐步升高有機相比例），避免流動相組成突變導致柱床塌陷。

2. 使用限制與保護措施

• 溫度與壓力限制：色譜柱使用溫度通常≤60℃（高溫會加速固定相流失），操作壓力需＜色譜柱最高耐受壓力（如常規 C18 柱耐受壓力≤400bar），壓力過高時需立即停機排查（可能因柱入口堵塞或流動相粘度異常）。

• 保護柱使用：分析復雜樣品時需加裝保護柱（如 C18 保護柱），保護柱與分析柱需同品牌同型號，定期更換保護柱（通常每分析 50-100 個樣品后更換），避免污染物進入分析柱。

五、檢測器操作注意事項

1. UV 檢測器

• 波長選擇與燈源保護：檢測波長需避開流動相截止波長（如甲醇截止波長 205nm，乙腈 190nm），避免基線噪聲增大；氘燈開關頻率不宜過高（每天開關≤1 次），超過使用壽命（2000 小時）需及時更換，否則影響檢測靈敏度。

• 流通池維護：避免長時間分析強保留樣品（如蛋白質、色素），防止流通池污染；若基線出現異常波動或鬼峰，需立即用 10% 硝酸水溶液沖洗流通池（注意流速≤0.1mL/min，防止壓力過高損壞池體）。

2. RID 檢測器

• 溫控與氣泡控制：RID 對溫度敏感，需確保柱溫箱與檢測器溫度一致（偏差≤±0.1℃），避免環境溫度波動；流動相必須脫氣，檢測過程中禁止改變流動相組成（梯度洗脫會導致基線漂移），僅適用于等度洗脫。

六、停機與系統維護

1. 短期停機（1-3 天）

• 泵與色譜柱處理：用純甲醇 / 乙腈以 0.5mL/min 流速沖洗系統 30 分鐘，色譜柱保持流動相流通（避免干燥），泵壓力設為 0，關閉檢測器燈源。

2. 長期停機（＞3 天）

• 沖洗與封存：緩沖鹽體系需先用 10% 甲醇 / 水沖洗 60 分鐘，再用純甲醇沖洗 30 分鐘；色譜柱兩端加堵頭垂直存放（反相柱用甲醇封存，正相柱用正己烷封存），泵頭內充滿甲醇防止密封墊干裂，檢測器流通池用甲醇沖洗后關閉電源。

七、安全與應急處理

1. 化學安全

• 操作有機溶劑時需在通風櫥內進行，避免吸入乙腈、四氫呋喃等有毒蒸氣；處理強酸強堿流動相（如 pH＜2 或＞10）時需佩戴手套和護目鏡，防止皮膚接觸或濺入眼睛。

2. 故障應急處理

• 漏液處理：發現泵頭、進樣閥或管路漏液時，立即停機并切斷電源，用吸水紙清理液體，檢查密封墊、管路接口或密封圈是否損壞（如泵密封墊磨損需及時更換）。

• 壓力異常：壓力突然升高時，先檢查過濾器（入口濾頭或在線過濾器）是否堵塞（可超聲清洗或更換），若壓力持續異常可能是色譜柱污染，需用高比例水相低速沖洗（如反相柱用 90% 水 / 10% 甲醇以 0.3mL/min 沖洗 2 小時），切勿強行提高流速。

總結

1. 流動相管理：嚴格過濾脫氣，緩沖鹽使用后必須沖洗；

2. 色譜柱保護：避免溫度、壓力超限，復雜樣品需用保護柱；

3. 檢測器維護：UV 燈源避免頻繁開關，RID 需嚴格控溫脫氣；

4. 安全意識：有機溶劑操作需通風，故障時先停機再排查。
   規范操作可降低儀器故障率，同時保證分析數據的準確性與重復性，延長設備使用壽命

高效液相色譜儀的使用離不開這個情況